烟碱型乙酰胆碱受体异质化在脓毒症致骨骼肌对非去极化肌松剂敏感性下降中的作用及机制研究

【摘要】目的研究不同病程阶段的脓毒症对非去极化肌松剂（Non-depolarizingneuromuscularblockagents，NMBA）量效及时效的影响；从神经肌接头（Neuromuscularjunction，NMJ）突触后膜烟碱型乙酰胆碱受体（Nicotinicacetylcholinereceptor，nAChR）的异质化探讨脓毒症导致NMBA药理学变化的发生机制；验证乌司他丁改善NMBA药效作用的有效性以及对NMJ突触后nAChR异质化的作用。方法第一部分选择健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠66只，鼠龄2~3月，体重200~220g，随机分为正常组（Normal组，n=6）、假手术组（Sham组，n=6）以及脓毒症组（Sepsis组）。Normal组大鼠不予任何处理。Sham组大鼠仅行开腹盲肠探查，不予盲肠结扎。Sepsis组大鼠通过盲肠结扎穿孔术（Cecalligationandpuncture，CLP）构建脓毒症模型。在建模（Sepsis组）或手术（Sham组）后第1天（Day1组，n=6）、第3天（Day3组，n=6）、第7天（Day7组：Sham组中n=6，Sepsis组中n=12）以及第14天（Day14组：Sham组中n=6，Sepsis组中n=12）进行指标检测和标本采集。按剂量累计法给予非去极化肌松剂维库溴铵（初始剂量为0.05mg/kg，以0.05mg/kg为递增剂量，最大剂量达到1mg/kg）。以0.1Hz频率刺激坐骨神经，检测单次肌颤搐收缩力，计算维库溴铵的最大单次肌颤搐抑制百分率（%），以相应药物剂量拟合量效曲线。通过软件得到维库溴铵的半数有效抑制浓度（IC50）和95%有效抑制浓度（IC95）。最后单次给予2×IC95的维库溴铵，记录药物起效时间、维持时间以及恢复时间。第二部分选择健康成年雄性SD大鼠60只，鼠龄2~3月，体重200~220g，随机分为Sham组以及Sepsis组。Sepsis组大鼠通过CLP构建脓毒症模型。Sham组大鼠仅行开腹盲肠探查术，不予盲肠结扎。各组分别在建模后1天（Day1组，n=6）、3天（Day3组，n=6）、7天（Day7组，Sham组中n=6，Sepsis组中n=12）以及14天（Day7组，Sham组中n=6，Sepsis组中n=12）进行指标检测和标本采集。各组大鼠分别在建模或手术前、后检测胫前肌复合肌动作电位（Compoundmuscleactionpotential，CMAP），测定其波幅和时程，计算运动神经传导速度（Motornerveconductionvelocity，MCV），同时测定单次肌颤搐收缩力。取大鼠胫前肌组织，运用免疫组化和免疫荧光法测定γ-nAChR和7-nAChR在骨骼肌细胞膜上的表达和分布；通过western-blot测定这两种蛋白表达量；采用RT-PCR法测定γ和7功能亚基mRNA的表达水平；取L4~L5节段脊髓前角神经组织，通过western-blot测定neuregulin-1蛋白表达量。第三部分选择健康成年雄性SD大鼠24只，鼠龄2~3月，体重200~220g，随机分为生理盐水对照组（0.9%N.S组，n=12）和乌司他丁组（Ulinastatin组，n=12）。各组大鼠通过CLP构建脓毒症模型，在建模后第10天静脉给予乌司他丁5000u/kg（Ulinastatin组）或给予等容量0.9%N.S（0.9%N.S组），每天1次，连续3天。各组大鼠在建模后第14天进行指标检测和标本采集。维库溴铵药效学研究方法同实验第一部分。神经电生理检测和蛋白检测检测同实验第二部分。结果第一部分（1）Sham组各亚组维库溴铵IC50与Normal组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Sepsis组中，Day1组维库溴铵IC50与Normal组和Sham组比较，差异无统计学意义（P>0.05）,其余各组与Normal组和Sham组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。Sham组各亚组之间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。Sepsis组各亚组之间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；Sepsis组和Sham组在建模/手术后同一时间的亚组比较，除Day1组差异无统计学意义（P>0.05），其余各组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）Normal组与Sham组各亚组的起效时间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Sham组各亚组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Sepsis组中，Day1组维库溴铵起效时间与Normal组比较，差异无统计学意义（P>0.05），其余各组与Normal组比较，差异均有统计学差异（P<0.05）。在建模后同一时间组比较，Sepsis组的Day1组和Sham组的Day1组差异无统计学意义（P>0.05），其余时间组比较，差异均有统计学差异（P<0.05）。Normal组与Sham组各亚组的维持时间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Sham组各亚组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Sepsis组中，Day1组维库溴铵维持时间与Normal组比较，差异无统计学意义（P>0.05），其余各组与Normal组比较，差异均有统计学差异（P<0.05）。在建模后同一时间组比较，Sepsis组和Sham组的维持时间在Day1差异无统计学意义（P>0.05），其余时间组比较，差异均有统计学差异（P<0.05）。Normal组与Sham组各亚组的恢复时间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Sham组各亚组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Sepsis组中，Day1组维库溴铵恢复时间与Normal组比较，差异无统计学意义（P>0.05），其余各组与Normal组比较，差异均有统计学差异（P<0.05）。在建模后同一时间组比较，Sepsis组和Sham组的恢复时间在Day1差异无统计学意义（P>0.05），其余时间组比较，差异均有统计学差异（P<0.05）。第二部分（1）Sham组各亚组的CMAP幅值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Sepsis组各亚组的CMAP幅值比较，差异有统计学意义（P<0.05）。Day1组幅值最高，Day14组CMAP幅值最低。Sepsis组和Sham组在建模后同一时间组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。Sham组各亚组的CMAP时程比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Sepsis组各亚组的CMAP时程比较，差异有统计学意义（P<0.05）。Day14组时程最长，Day1组CMAP时程最短。Sepsis组和Sham组在建模后同一时间组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。Sham组各亚组的MCV比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Sepsis组各亚组的CMAP幅值比较，差异有统计学意义（P<0.05）。Day1组MCV最高，Day14组MCV最低。Sepsis组和Sham组在建模后同一时间组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。（2）Sham组各亚组的肌颤搐收缩力比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Sepsis组各亚组的肌颤搐收缩力比较，差异有统计学意义（P<0.05）。Day1组肌颤搐收缩力最高，Day14组肌颤搐收缩力最低。Sepsis组和Sham组在建模后同一时间组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。（3）与Sham组比较，脓毒症Day1、Day3、Day7以及Day14组的大鼠骨骼肌γ-nAChR蛋白表达逐渐增高；在脓毒症建模后14天，γ-nAChR蛋白表达最高，差异有统计学意义（P<0.05）。γ-nAChR蛋白分布于骨骼肌细胞膜上。γ-nAChR功能亚基γ亚基mRNA表达的变化趋势与蛋白表达变化趋势一致。与Sham组比较，脓毒症Day1、Day3、Day7以及Day14的大鼠骨骼肌7-nAChR蛋白表达逐渐增高；在脓毒症建模后14天，7-nAChR蛋白表达最高，差异有统计学意义（P<0.05）。7-nAChR功能亚基7亚基mRNA表达的变化趋势与蛋白表达变化趋势一致。（4）与Sham组比较，Sepsis组各组的大鼠骨骼肌终板膜增高；脓毒症Day1、Day3、Day7以及Day14组的大鼠骨骼肌终板膜比较，差异有统计学意义（P<0.05）。随着脓毒症模型建模时间越长，终板膜的面积逐渐增加。（5）与Sham组比较，脓毒症Day1、Day3、Day7以及Day14组的大鼠脊髓背角神经元的neuregulin-1蛋白表达降低；在脓毒症建模后14天，neuregulin-1蛋白表达达到最低，差异有统计学意义（P<0.05）。随着脓毒症模型建模时间越长，neuregulin-1蛋白表达逐渐降低。第三部分（1）Ulinastatin组大鼠胫前肌CMAP的幅值和神经传导速度与0.9%N.S组大鼠比较，差异有统计学意义（P<0.05），而时程比较，两组差异无统计学意义（P>0.05）。（2）Ulinastatin组大鼠胫前肌单次肌颤搐收缩力高于0.9%N.S组大鼠，差异有统计学意义（P<0.05）。（3）与0.9%N.S组比较，Ulinastatin组大鼠胫前肌γ-nAChR蛋白表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）。同样，Ulinastatin组大鼠胫前肌γ-nAChR功能亚基γmRNA表达水平低于0.9%N.S组（P<0.05）。与0.9%N.S组比较，Ulinastatin组大鼠胫前肌7-nAChR蛋白表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）。Ulinastatin组大鼠胫前肌7-nAChR功能亚基7mRNA表达水平低于0.9%N.S组（P<0.05）。（4）与0.9%N.S组比较，Ulinastatin组大鼠脊髓背角神经元neuregulin-1蛋白表达增高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论（1）脓毒症导致骨骼肌对非去极化肌松剂敏感性下降，表现为肌松作用下降，肌松起效时间延长，维持时间和恢复时间缩短。同时，脓毒症导致神经肌肉功能障碍，骨骼肌收缩力下降，复合肌动作电位幅值降低，神经传导速度减慢，发生脱髓鞘改变；（2）脓毒症导致骨骼肌细胞膜上胎儿型乙酰胆碱受体γ-nAChR和神经型乙酰胆碱受体7-nAChR表达升高，并分布于骨骼肌整个细胞膜。脓毒症的非去极化肌松剂的肌松作用下降与这两种非成熟型nAChR受体的表达有关；（3）蛋白酶抑制剂乌司他丁可抑制脓毒症导致的骨骼肌细胞膜上γ-nAChR和7-nAChR的表达上调，促进神经肌肉功能的恢复，改善骨骼肌对非去极化肌松剂的敏感性
【作者】刘力；
【导师】闵苏；
【作者基本信息】重庆医科大学，麻醉学，2014，博士
【关键词】脓毒症；非去极化肌松剂；烟碱型乙酰胆碱受体；药理学；电生理；蛋白酶抑制剂；

【参考文献】
[1]周雪梅.试论墨子思想的人民性[D].首都师范大学,马克思主义理论与思想政治教育,2004,硕士.
[2]邵琦.偏载动压滑动轴承实验台的研制及油膜压力的研究[D].哈尔滨工业大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[3]刘琳.铁路全程物流服务价格体系研究[D].北京交通大学,2015.
[4]白雪.基于类等势场法的锻造预成形优化设计研究[D].山东大学,材料加工工程,2013,硕士.
[5]袁梓淇.我国上市公司并购绩效的实证研究[D].厦门大学,金融学,2014,硕士.
[6]刘青.B2C网站品牌资产构成对顾客重复购买行为的影响研究[D].南京师范大学,企业管理,2012,硕士.
[7]薛慧光.中国式分权对地方政府土地出让行为的影响研究[D].南京农业大学,土地资源管理,2012,硕士.
[8]宋静.AMPA受体外化在铝致大鼠海马LTP损害中的作用及其信号转导机制研究[D].山西医科大学,劳动卫生与环境卫生学,2014,博士.
[9]徐娟.薄膜太阳能电池电极材料及陷光结构的构建与研究[D].天津理工大学,物理电子学,2013,硕士.
[10]李宇翔.嵌入式高清视频监控系统的设计与实现[D].华中科技大学,软件工程,2013,硕士.
[11]龙艳.短命植物镰荚黄耆种子萌发及生活史特征[D].新疆农业大学,植物学,2012,硕士.
[12]付玲馨.长沙市区域性物流中心城市建设研究[D].湖南师范大学,人文地理学,2014,硕士.
[13]唐小付.不同钾、钙、镁水平对厚皮甜瓜生长发育和产量品质的效应研究[D].广西大学,植物营养学,2004,硕士.
[14]刘梦甦.走私罪在立法中存在的问题及完善对策[D].中国社会科学院研究生院,刑法学（专业学位）,2014,硕士.
[15]谭宏卫.双目标Logistic回归模型的构造理论及其统计推断[D].贵州民族大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[16]陈卓.河南省信阳地区不同宿主梨形虫感染研究[D].中国疾病预防控制中心,流行病与卫生统计学,2014,博士.
[17]周文.微动疲劳裂纹萌生特性及寿命预测[D].浙江工业大学,2007.
[18]郭红建.基于软件Agent的应用过程信息审计平台的设计与实现[D].南京航空航天大学,2003.
[19]隆环宇.四川移动公司集团客户专线项目进度保障及对策研究[D].西南交通大学,工商管理,2012,硕士.
[20]吴艳梅.女性海归知识员工主观幸福感及其与工作绩效的关系[D].华东师范大学,企业管理,2013,硕士.
[21]刘倩.典型环境内分泌干扰物对MCF-7细胞的增殖毒性及初步机理探讨[D].上海大学,环境工程,2013,硕士.
[22]金书鑫.停车产业化环境下社会公共停车场建设效益评估[D].长安大学,交通运输规划与管理,2014,硕士.
[23]张传斌.基于CAN总线的移动机器人分布式控制系统研究[D].山东大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[24]周勇.基于农业产业集群的地理标志品牌建设研究[D].首都经济贸易大学,产业经济学,2013,硕士.
[25]刘培林.进展期胃癌的治疗进展[D].苏州大学,临床医学（专业学位）,2014,硕士.
[26]程辞.兰州市居民食品消费碳足迹研究[D].兰州大学,区域经济学,2013,硕士.
[27]徐博华.MN公司内部控制评价及改进[D].内蒙古大学,工商管理,2012,硕士.
[28]米瑞婕.中国与新加坡公务员财产申报制度比较研究[D].山西师范大学,行政管理,2014,硕士.
[29]高洋.大触摸屏上目标选择技术研究与设计[D].吉林大学,计算软件与理论,2013,硕士.
[30]黄熙.四川盆地三叠纪盐盆富钾卤水富集规律[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2013,硕士.
[31]赵靖.马克思人的全面发展理论和大学生全面发展教育研究[D].山西师范大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[32]程蒙.基于粒子群优化的无线传感器网络节点定位算法研究[D].华中师范大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[33]江玲玲.辽宁省与吉林省边界区域经济合作研究[D].东北大学,政治经济学,2011,硕士.
[34]肖优.汉代云气纹样在家具设计中的应用研究[D].中南林业科技大学,设计艺术学,2013,硕士.
[35]曾媛.对中老年声乐教学的探究[D].湖南师范大学,音乐学,2014,硕士.
[36]俞律.绝热电路漏功耗减小技术[D].宁波大学,电路与系统,2013,硕士.
[37]沈建国,陈宇,张海澜,袁福文,张济祥.SKC-B大数控声波全波测井仪的数值研究[J].石油地球物理勘探,2002,02:149-153+200.
[38]姜志亮.宽压高效DC/DC模块电源设计[D].北方工业大学,电路与系统,2013,硕士.
[39]傅莹莹.糖尿病合并抑郁状态患者患病情况及相关内分泌激素变化的临床研究[D].北京中医药大学,中医学,2014,硕士.
[40]赵稳军.碳纳米管振动和屈曲特性的数值模拟[D].重庆大学,2011.
[41]刘思辰.木材表面纳米TiO_2疏水薄膜的构筑及其耐光老化性能研究[D].中南林业科技大学,木材科学与技术,2014,硕士.
[42]刘振华.有价证券诈骗犯罪的认定与预防[D].湘潭大学,法律,2002,硕士.
[43]黄颖.公司注册资本法律问题研究[D].中国社会科学院研究生院,经济法学,2003,硕士.
[44]岳仁超.电池管理系统的研究[D].北京交通大学,2010.
[45]刘成斋,冉建斌,杨永生,赵伟森,王新红,贺振华,杨绍国.稀疏脉冲和基于模型反演在王家岗沙四段砂岩油藏精细勘探中的应用[J].石油地球物理勘探,2002,04:401-406+432.
[46]蔡璇.臭氧/游离氯及其组合工艺对饮用水中病毒灭活影响因素研究[D].复旦大学,环境工程,2012,硕士.
[47]沈劲松.第四届全国体育大会后期对合肥市商业健身俱乐部发展现状与对策研究[D].南昌大学,体育人文社会学,2012,硕士.
[48]周倩.精品饭店品牌联想对顾客行为倾向的影响研究[D].浙江大学,2012.
[49]尹璐.甲型血友病的基因诊断方法研究[D].河北医科大学,遗传学,2014,硕士.
[50]王冶.对赌协议法律效力分析[D].中国社会科学院研究生院,商法（专业学位）,2014,硕士.